材料和方法

1 材料

1． 1 药品与试剂葛根素( 新乡恒久远药业有限公司，批号20121201) ，氟西汀( fluovetine，FLU，苏州礼来制药，批号2076AC) ，小鼠5-HT 试剂盒( 批号20140503) 、小鼠NE 试剂盒( 批号20140607) 、小鼠DA 试剂盒( 批号20140708) 均为北京诚林生物技术有限公司分装，CＲEB-1( 批号999802W) 、p-CＲEB-1( 批号140601) 、BDNF ( 批号140526 ) 、TrkB ( 批号旷场9H124) 、β-actin( 批号140120) 多克隆抗体均购于北京博奥森生物技术公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。

1． 2 主要仪器旷场反应箱( hth入口 ) ，强迫游泳水缸( hth入口 ) ，ECLIPSE 50i 型显微镜及摄像系统( 日本Nikon) ，DT1001 电子天平( 常熟市意欧仪器仪表有限公司) ，HTT700T 透射电子显微镜( 日本日立公司) ，5026 型酶联**检测仪( 奥地利TECAN 公司) ，MＲ1812 型台式高速低温离心机( 法国JOUAN公司) ，PUEELAB PLUS 超纯水系统( 美国波尔公司) ，DYY-Ⅲ27B 垂直电泳槽及稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) ，TS-100 脱色摇床( 南京庚辰仪器有限公司) ，UV-2550 型紫外分光广度仪( 日本岛津) ，MDF-492 超低温冰箱( 日本三洋) ，METTLEＲ TOLEDOPH 测试仪( 上海秋腾贸易公司) ，Cetrfuge5417Ｒ小型高速台式离心机( 上海富众生物科技公司) 等。

1． 3 实验动物清洁级雌性昆明小鼠，体质量( 20g ± 2 g) ，购自黑龙江中医药大学****评价中心，生产许可证号［SCXK( 黑) 2013-0004］。

2 方法

2． 1 动物分组、模型制备及给药OFT 筛选评分相近、体重均匀小鼠50 只，适应性饲养1 周。饲养条件为，5只/笼，室温( 22 ± 1) ℃，湿度( 50 ± 10) %，自然光照( 12L /12D) ，自由摄食饮水。根据SPSS 19． 0统计软件产生随机数字分为5 组，即假手术组( Sham) 、围绝经期抑郁症模型组( OVX + CUMS) 、氟西汀组( 3 mg /kg) 、雌**组( 0． 15 mg /kg) 、葛根素组( 92 mg /kg) ，每组10 只。采用小鼠双侧卵巢切除( OVX) 联合慢性不可预知性温和应激( CUMS) 法制备围绝经期抑郁症动物模型，其中假手术组小鼠仅剪去卵巢旁体积相同脂肪组织。术后常规饲养7 d后，除Sham 组外，其余各组给予CUMS，方法为禁食( 24 h) 、禁水( 24 h) 、昼夜颠倒( 12 D/12 L) 、冰水游泳( 5 min) 、45℃环境热烘( 5 min) 、夹尾( 1 min) 、潮湿垫料、电击足底等7 种刺激，这7 种刺激每天随机采取一种，每天刺激都不规律。各给药于每日应激前1 h 灌胃给药，其余各组给予等体积的生理盐水灌胃，每日每次0． 2 ml，共计21 d。

2． 2 指标测定2． 2． 1 上皮角化实验7 d 内连续监测各实验组小鼠上皮脱落细胞相，观察动情周期变化，以证明去势是否成功。

2． 2． 2 旷场实验( open filed test，OFT) 制备小鼠旷场反应箱( 40 cm × 40 cm × 38 cm) ，内壁涂黑，底面平均划分25 个小格。选取安静场地，将小鼠放入反应箱中央，摄像系统记录动物在旷场内6 min 的行为学表现，计算水平运动( 3 或4 只脚同在一个格内计1 分，穿越1 格计1 分，沿线行走每8 cm 计1分) 及垂直运动得分( 记录小鼠站立次数; 双前足离

地1 次为1 分) 。两只动物之间用75% 酒精擦拭底部及四壁，以免“前任者效应”。实验在应激第1 d、21 d( 9∶ 00 ～ 11∶ 00) 各测定1 次。

2． 2． 3 强迫游泳实验( force swimming test，FST)

将小鼠单独置于水深15 cm 的玻璃缸内( 高20 cm，直径14 cm) ，水温( 25 ± 1) ℃，游泳6 min，观察记录后4 min 内小鼠在水中累计不动时间。每只小鼠实验结束后冲洗水缸、换水，避免对下一只测试小鼠产生影响。实验在应激第1 d、21d( 9∶ 00 ～ 11∶ 00) 各测

定1 次。

2． 2． 4 体质量测试( body weight measurement，BWM) 在实验第1 d、21 d 分别进行小鼠体质量测定。

2． 2． 5 尼氏染色行为学测试结束后第2 d，心脏灌流固定取脑，石蜡切片脱蜡至水，经尼氏染色、脱水、透明及封固后，光镜观察海马组织神经元形态学变化并拍照。

2． 2． 6 透射电镜行为学测试结束后第2 d，断头取脑，切取小鼠海马组织( 1 mm × 1 mm × 5 mm) ，2．5%戊二醛和1% 锇酸4℃固定2 h，双蒸水冲洗，酒精梯度脱水，环氧树脂包埋，醋酸铀及枸橼酸铅染色，透射电镜观察并拍照。

2． 2． 7 脑组织单胺类递质5-HT、NE 及DA 含量测定行为学测试结束后第2 d，断头取脑，冰台上迅速取小鼠脑组织并称取重量。匀浆，4℃、3000 rpm/min － 1离心20 min，静止，吸取上清，－ 80℃保存。按照ELISA 试剂盒说明书操作方法，测定脑组织单胺类神经递质5-HT、NE 及DA 含量。

2． 2． 8 海马组织CＲEB-BDNF 信号通路主要蛋白含量测定行为学测试结束后第2 d，断头取脑、剥离海马，投入液氮冻结。冰上研磨，经蛋白质抽提、定量、电泳、转膜及显色后，AlphaimagerTM 凝胶图像分析系统扫描，测定光密度。采用目的条带与内参蛋白条带密度比值作为结果进行统计分析。

统计学处理: 实验数据均为计量资料，应用SPSS 19． 0 统计分析软件对数据进行整理，并以均数± 标准差( 珋x ± s) 表示。多组数据差异性检验采用One-Way ANOVA，组间均数两两比较应用LSD 检验，以P ＜ 0． 05 表示差异具有统计学意义。

 结果

1 小鼠动情周期变化

动物脱落细胞相随性周期呈现规律变化，我们进行上皮角化实验可鉴定小鼠性周期变化，并判定动物去势是否成功。结果显示，与Sham组比较，各OVX 组小鼠脱落细胞呈现大量白细胞和少量上皮细胞，7d 内连续监测无周期性细胞变化，证明小鼠去势成功，并可进行下一步实验( Fig． 1) 。

2 葛根素对围绝经期抑郁症模型小鼠行为学影响

2． 1 OFT 结果造模第1 d，各组小鼠OFT 水平运动及垂直运动得分比较，差异无统计学意义( P ﹥0． 05) 。在应激第21 d，与sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠OFT 水平运动得分、垂直运动得分减少( P ＜ 0． 01或P ＜ 0． 05) ; 与围绝经期抑郁症模型组比较，给予

FLU、E 和Pue **后可增加OFT 水平运动及垂直运动得分( P ＜0． 01 或P ＜0． 05) ，差异显著( 表1) 。

2． 2 FST 结果造模第1 d，各实验组小鼠强迫游泳不动时间比较无显著性差异( P ＞ 0． 05) 。在应激第21 d，与Sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠游泳不动时间增加( P ＜ 0． 01) ; 与围绝经期抑郁症模型组比较，FLU 组、E 组、Pue 组小鼠游泳不动时间减少( P ＜ 0． 01) ，差异显著( 表2) 。

2． 3 BWM 结果造模第1 d，各实验组小鼠体质量比较差异无显著性差异( P ＞ 0． 05) 。在应激第21d，与sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠体质量减少( P ＜ 0． 01) ; 与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU、E 及Pue **后，各组小鼠体质量增加( P ＜ 0． 01 或P ＜ 0． 05) ，差异显著( 表2) 。

3 葛根素对围绝经期抑郁症模型小鼠海马组织形态学影响

3． 1 海马组织神经元形态学观察与Sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠海马CA3 区神经元分层不清，排列不规则，部分神经元丢失、数量减少及萎缩，尼氏体数量减少。与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU、E 及Pue **后，可改善海马CA3 区神经元损伤，表现为神经元分层明显，排列较规则、胞膜较完整，胞核形态正常，尼氏体数量增加( Fig． 2)  

3． 2 海马组织超微结构与Sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠海马区神经元微绒毛及细胞链接消失，胞质内细胞器少，线粒体嵴絮状变性，突触结构减少，核内异染色质聚集、呈现凋亡早期变化;与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU、E 及Pue**后，可改善海马区神经元损伤，表现为神经元形态较规则、胞膜表面有微绒毛及细胞链接，核膜清楚完整，线粒体嵴清晰、突触结构完整，数量适中Fig． 3) 。

4 葛根素对围绝经期抑郁症模型小鼠脑组织单胺类递质含量影响与Sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠脑组织5-HT、NE 及DA 含量减少( P ＜ 0． 01) ; 与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU、E 及Pue **后，小鼠脑组织5-HT、NE 及DA 含量增加( P ＜ 0． 01

或P ＜ 0． 05) ，差异显著( 表3) 。

5 葛根素对围绝经期抑郁症模型小鼠海马组织CＲEB-1、p-CＲEB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表达影响与sham 组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠海马组织CＲEB-1、p-CＲEB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表达下降( P ＜ 0． 01) ; 与围绝经期抑郁症模型组比较，FLU 组、E 组及Pue 组小鼠海马组织CＲEB-1、p-CＲEB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表达增加( P ＜ 0． 01 或P ＜ 0． 05，表

4，Fig． 4) 。

 讨论

海马为脑边缘系统之一，发出神经纤维投射到额叶皮质、杏仁核等与情感有关的关键脑区，参与学习、记忆及情绪调节，对负性情绪高度敏感且易损伤，在生理及病理条件下具有神经可塑性。研究证实，长期慢性应激可诱导生物体海马神经元损伤，雌**低下可影响脑组织单胺类神经递质的合成、神经元生长、突触形成等。因此，慢性应激与雌**低下相互作用、相互影响共同成为围绝经期抑郁症致病内、外两个主要因素。

在本研究中，我们以FLU、雌**作为阳性对照**，从五个方面评价葛根素对围绝经期抑郁模型小鼠的**作用。一是在模型制备中，我们采用OVX联合CUMS 法制备围绝经期抑郁症动物模型，该方法较大程度模拟了围绝经期抑郁症的核心症状及相似病因、可操作性强，预实验表明采用OVX + CUMS方法在造模效果上不相互干扰。二是动物行为学测试，是评价模型是否制备成功及**是否有效的标准，在动物行为学测试中，我们采用OFT 测试动物水平及垂直运动得分，评价动物“自发活动及探索行为”，采用FST 及BWM 模拟临床抑郁症患者“行为

绝望”及“食欲减退、体重减低”的体征。三是通过观察动物海马组织病理形态学变化，揭示引发动物抑郁样行为的物质基础。四是依据抑郁症“单胺类神经递质缺乏”学说，评价环境应激、雌**缺乏与下丘脑-垂体-肾上腺素轴( hypothalamic pituiary adrenalaxis，HPA) 轴之间的联系。五是依据抑郁症**新策略-靶向神经可塑性。“CＲEB-BDNF 信号通路功能紊乱”是抑郁症发**展的枢纽环节［9］，该通路在情绪调节中起重要作用，并与抑郁症“海马神经可塑性失调”密切相关，为神经可塑性调节的关键环节之一。该通路相关蛋白及因子的表达在抑郁症发病及抗抑郁**起效过程中起重要作用［11］，并对海马神经元增殖、分化、存活及可塑性调节都具有影响。

   结果显示，围绝经期抑郁症模型组小鼠表现抑郁样行为与海马神经元损伤、神经元早期凋亡，脑组织单胺类神经递质缺乏，CＲEB-BDNF 信号通路主要蛋白CＲEB-1、p-CＲEB-1、BDNF 及TrkB 表达减少密切相关。葛根素因化学结构与动物雌**相似性而具有抗围绝经期抑郁症活性及神经保护作用，其机制可能涉及抑制小鼠海马神经元损伤、凋亡，上调脑组织单胺类神经递质5-HT、NE、DA 含量，上调CＲEB-BDNF 信号通路主要蛋白表达而实现的。

  综上所述，雌**缺乏引发海马神经元损伤及早期凋亡为围绝经期抑郁症模型动物神经生化改变的物质基础，葛根素通过影响CＲEB-BDNF 信号通路功能而调控围绝经期抑郁症模型小鼠海马神经可塑性变化。但具体有关应激、雌**、神经递质与CＲEB-BDNF 信号通路的关联尚需进一步探讨。