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新物体识别实验旷场实验对大鼠成年后物体识别的影响

临床工作中经常遇到婴幼儿患者因病情需要接受多次手术麻醉,如烧创伤、整形患儿7~10d进行一次切痂植皮,或喉乳状瘤患儿约20d进行一次近6h全身麻醉下的手术,对于此类患儿在大脑发育期经历多次(≥3次)异氟烷吸入麻醉对其随后的认知功能是否有影响目前尚不明确。本课题组既往研究发现,多次间隔时间较短的异氟烷处理对随后的空间认知功能(八臂迷宫、水迷宫等)有一定影响,但对于非空间记忆如物体识别能力是否有影响,以及如何减弱或避免该影响尚未见报道。目前已知规律运动对不同年龄段的认知均具有促进作用,尤其在幼年时期的作用更为显著,因此,本研究应用物体识别行为学实验(object recognitiontask,ORT)探索了发育期多次异氟烷处理后进行规律运动对大鼠成年后非空间认知功能中物体识别能力的影响及其性别差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 生后7d(P7)的SD大鼠110只,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,动物合格证编号:11401300035796。按随机数字表法将大鼠分为正常对照组(Naive)、运动组(Naive+PE)、异氟烷组(Iso)和异氟烷运动组(Iso+PE)。实验前测量各组大鼠体重,P7、P9和P11时,Naive及Naive+PE组大鼠在上午8:00放置于透明有机玻璃麻醉诱导箱中自由呼吸空气2h;而Iso及Iso+PE组大鼠则暴露于异氟烷中2h。大鼠P21时,Naive+PE和Iso+PE组大鼠开始规律运动训练6周,随即进行旷场实验及**次物体识别测试,运动训练结束后4周,再次进行物体识别实验,以评价运动后的近期(P67)及远期(P95)效果。新生大鼠和母鼠单笼饲养,出生3周后按雌雄分笼。实验室温度25±1℃,相对湿度45%~55%,行为学实验时用75%乙醇擦拭实验装置及物体。实验方案通过医院动物伦理委员会批准,动物处置过程中所有操作均符合动物伦理学标准。

1.2 异氟烷处理 采用实验动物麻醉机(美国MATRX公司)以3%异氟烷(山东鲁南贝特,生产批号64140302)诱导,1.5%异氟烷与30%氧气混合吸入维持2h。通过检查幼鼠呼吸频率及每15min夹尾确保其存活,采用ALC-HTP动物恒温系统(上海奥尔科特)维持体温在36.5±0.5℃,开启CO2吸附器吸收废气。

1. 3 大鼠运动方案 P21 时两组运动大鼠每天1 4 : 0 0 ~ 1 7 : 0 0 训练, 应用XR -PT-10A小动物跑台( hth入口 ) 跑台是相互间隔的6 条跑道, 每条跑道有效空间为600mm×95mm×115mm,跑台0°倾角不变,运动强度逐渐加大,幼鼠在跑台上先适应10min,从4m/min开始,每周增加2m/min至14m/min,30min/d,每周5d,持续6周;运动后统一送回动物房饲养,剔除因受伤等未完成6周训练的大鼠。

1.4 旷场实验 用于评估动物一般运动能力及探索行为。旷场箱高40cm,长宽均为100cm,动物在安静黑暗实验室中适应30min,将每只动物放入箱内中心位置,并进行录像和计时,任其自由探索5min,分析动物在旷场中央区及周围区所待时间。

型号:XR-XZ301

1.5 新物体识别实验 应用旷场测试箱,利用啮齿类动物喜欢接触和探索新奇事物的天性检测动物非空间记忆能力。实验分为三步。① 适应阶段( hab i t u a t i o nsession):将大鼠依次放入没有任何物体的测试箱中,适应实验环境,连续3d,共6次。②熟悉阶段(sample session):在距侧壁10cm处放入两个相同物体——黄色玻璃瓶(F1和F2,高11cm×宽4.8cm),将大鼠以背对物体方向放入,自由探索5min后将大鼠取出,记录大鼠物体探索时间。③测试阶段(test session):24h后进行测试,将两个相同物体中F2替换成另一物体N,即熟悉物体(F1)和新奇物体(N),记录大鼠5min对两物体的探索时间。F1和N的位置随机置换,以避免位置偏倚。探索活动定义为:大鼠鼻子在≤2cm范围内直指向物体或直接接触物体时的行为,大鼠转头或坐在物体上时不被认为是对物体的探索。P67时**次测试时新奇物体N为红色塑料瓶(高11cm×宽7cm);P95时**次测试新奇物体N为金属镊筒(高12cm×宽7cm)。

检测指标: 采用动物行为分析系统( hth华体会官网com 动物行为分析软件) 对旷场及物体识别实验中各物体的探索时间进行分析。物体识别辨别指数用DR(discrimination ratio)表示。DR=(N–)/(N+F)。

“N”为大鼠对新奇物体的探索时间,“F”为大鼠对熟悉物体的探索时间。DR范围为[–,1],

“–”提示大鼠完全偏向于熟悉物体,而“1”则完全偏向于新奇物体。


1.6 统计学处理 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 随日龄增长,各组大鼠体重增加,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。异氟烷处理后,各组内、组间雌/雄幼鼠动脉血气分析结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。饲养及运动训练过程中剔除受伤或拒绝运动大鼠18只(雄性11只,雌性7只),*终Naive组雌鼠15只、雄鼠11只,Naive+PE组雌鼠13只、雄鼠10只,Iso组雌鼠10只、雄鼠12只,Iso+PE组雌鼠11只、雄鼠10只。

2.2 旷场实验结果 与Naive组相比,各组大鼠在旷场中央区及周围区探索时间差异均无统计学意义(P>0.05,表1),提示发育期多次异氟烷处理及是否规律运动对大鼠成年后焦虑、探索等自主行为没有明显影响。

2.3 发育期多次异氟烷处理对大鼠成年后物体识能力的影响 与非运动组相比,无论是否经过异氟烷处理,运动组(Naive+PE)雄鼠DR均明显增强,差异有统计学意义(与Naive组及Iso组比较,P67时P=0.050、P=0.017,P95时P=0.037、P=0.019;图2);而运动组雌鼠与Naive组相比,P67时DR无明显差异(P=0.252);与Iso组相比,P67时运动雌鼠DR显著下降(P=0.036),到P95时,与Naive组相比,运动组雌鼠DR明显增强(P=0.004),与Iso组相比,运动组雌鼠DR也有增强趋势(P=0.095)。此外,在P95时,Naive+PE组和Iso组雄鼠的DR及Naive+PE组和Iso+PE组雌鼠的DR均较P67时明显增强,差异有统计学意义(P=0.032,P=0.022,P=0.007,P=0.002)。结果提示运动对雄性大鼠的物体识别能力有明显促进作用,而对雌性大鼠的促进作用主要1 运动对异氟烷处理大鼠成年后旷场实验结果的影响别能力的影响 在P67和P95时各组大鼠探索时间比较,组内即组建差异均无统计学意义(P>0.05)。物体识别测试发现:与Naive组相比,Iso组雌性大鼠在P67时的辨别指数DR明显增强(P=0.034),但到P95时仅出现降低趋势,但差异无统计学意义(P=0.173);而Iso组雄性大鼠在P67和P95时DR均有增强趋势,但差异无统计学意义(P=0.341,P=0.052,图1)。提示发育期异氟烷处理对于不同性别大鼠成年后物体识别能力的影响存在性别差异,且均无明显的功能损害。

2.4 运动对多次异氟烷处理大鼠成年后物体识别能力

2.5 运动对异氟烷处理大鼠成年后物体识别能力影响的性别差异 与雄鼠相比,P67时非运动组雌鼠DR明显较强,差异有统计学意义(Naive组,P=0.022;Iso组,P=0.011);到P95时,仅没有经过异氟烷处理的两组雌鼠DR高于雄鼠,差异有统计学意义(Naive组,P=0.008;Naive+PE组,P=0.017,图3)。提示雌鼠的物体识别能力明显优于雄性,但运动能够明显促进雄鼠的物体识别能力的提升。


3 讨  论

临床及基础研究显示, 发育期接受多次麻醉和手术是导致学习障碍的独立影响因素其中麻醉物在大脑发育期产生的神经发育毒性(anesthesia-induced developmental neurotoxicity,AIDN)对成年后认知功能的影响也一直备受关注,但目前尚未有明确的结论。本研究发现,生后发育期多次异氟烷处理对大鼠成年后非空间认知功能中的物体识别能力无明显损害,并证实运动能够促进大鼠成年后的物体识别能力,且具有明显的性别差异,雄性大鼠的运动获益较为明显,而雌鼠的获益主要体现在运动后的远期效果上。

物体识别实验是测试大鼠物体识别能力的常用方法,*早由Ennaceur等报道,利用啮齿类动物喜欢探索新事物的自发行为进行评价。应用该方法时实验动物无须食物诱导,没有强烈的厌烦因素(如水迷宫中等游泳压力等),避免了情绪波动的影响,较为客观准确。尽管发育期异氟烷处理对大鼠成年后在八臂迷宫及水迷宫的空间记忆能力具有一定影响,但在本研究中对大鼠物体识别能力未产生明显损害,甚至在P67时雌鼠及雄鼠的物体识别能力表现出增强趋势,但P95时测试发现对雌鼠对识别能力存在一定的损害趋势。可能的原因为吸入麻物可通过降低脑代谢、减少氧耗、增加氧供而抑制神经元受损,从而起到神经保护作用,如有研究显示麻醉**药丙泊酚对脑损伤具有一定的保护作用。人类及动物研究均证实,雌性的整体认知发育明显早于雄性,发育期异氟烷处理对雌性认知功能对损害可能会延续到远期,而雄性仍在发育阶段,给予一定程度的刺激可能促进大脑神经重塑及修复等机制,反而促进其未来认知的发育,但其具体作用及机制仍需进一步研究。运动作为环境刺激的一部分,对大脑认知功能的影响因运动强度与时长不同而不同,如低强度运动明显促进海马齿状回神经细胞增殖,增高神经营养因子(BDNF)水平,刺激树突分支形成、突触发生等,尤其在大脑发育阶段作用更为明显。本研究发现,无论是否经历发育期异氟烷处理,运动均可明显促进雄性大鼠但物体识别能力。该结果与Hopkins等的研究一致,他们发现雄性大鼠经过4周自愿运动后物体识别记忆能力明显提高,且大脑嗅周皮质(PER)内BDNF水平升高。但对于雌鼠,在运动后1周的测试中,运动组物体识别能力未见明显提高,直到运动结束后4周,运动促进物体识别能力提高等效果才有所显现。以往研究也证实,发育期接受运动对大鼠认知功能的影响较成年大鼠能够持续更长时间。上述结果提示发育期进行运动锻炼能够对机体产生更为持久的作用。既往的基础研究多选用雄性动物,以避免雌孕**水平波动而干扰实验结果,但认知水平的发展是具有性别差异的,从八臂迷宫测试中可以发现,雌鼠认知行为表现明显强于雄鼠。雌孕**增强神经可塑性,提高大鼠对物体识别能力。相比空间记忆,雌**对物体识别记忆的影响更为明显。本研究也证实,P67时除Iso+PE组外,其余各组雌鼠的表现明显优于雄性;在P95时,非异氟烷处理的两组雌鼠物体识别能力依然强于雄鼠。上述研究发现对于探索雌孕****年龄相关性记忆减退或其他认知障碍性**具有重要的指导意义。

综上所述,发育期多次异氟烷处理及运动对大鼠成年后物体识别能力对影响均具有性别差异,雌鼠的物体识别能力明显优于雄性,但运动对物体识别能力的促进作用在雄鼠更为明显,雌鼠仅体现为远期效应。本研究对于探讨临床经历多次手术麻醉的患儿成年后对物体识别能力提供了可参考的实验证据,提示运动对于此类患儿具有重要意义,尽管存在性别差异,但运动均可促进远期物体识别能力的增强,减轻可能存在的AIDN所引起的认知损害。但对于雌孕**是否具有确切的促进认知的作用,仍需进一步研究探索。

沪公网安备 31011202007432号

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