摘要: 旷场实验高架十字迷宫对焦虑大鼠血清水平的影响

目的:研究旷场实验高架十字迷宫对焦虑大鼠血清水平的影响白香丹胶囊对焦虑模型大鼠血清及脑区脑源性神经营养因子(BDNF)水平的影响及焦虑症发病相关**机制。

方法:采用足底电击法(Foot Shock-FS)诱发大鼠焦虑样行为，以旷场实验和高架十字迷宫实验对其进行行为学检测、ELISA检测大鼠血清BDNF含量、Western  blot检测大鼠脑区BDNF蛋白的表达。

结果:与空白组比较，模型组大鼠旷场实验总路程增加(P<0.01)，高架十字迷宫实验进入开放臂次数百分数(OE %)和开放臂停留时间百分数(OT%)均降低(P < 0. 0l) , ELISA实验所测大鼠血清BDNF水平降低(P < 0. 0l ) , Western blot检测大鼠各脑区(左海马、右海马、额叶、下丘脑)BDNF蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组比较，白香丹组和地西洋组大鼠运动总路程均降低(P < 0. 05) ,OE%和OT%均升高(P < 0. 05) , BDNF水平均升高(P < 0. 05)，各脑区BDNF蛋白表达水均升高(P < 0. 05或P<0.01).

结论:中药白香丹胶囊对足底电击法诱导大鼠焦虑样行为具有明显的拮抗作用，BDNF是其作用靶点之一。

      焦虑是精神障碍五大症状群之一，其发病率呈现逐年上升的趋势，严重影响着患者的生活质量，越来越受到人们的重视。目前，焦虑症的病因和发病机制不明确，神经发生假说是当今研究的一个热点。脑源性神经营养因子(brain derived neurophic; factor. BDNF)是脑内含量*多的神经营养因子，对神经元的生长发育、分化、存活、损伤后修复等起重要作用，与包括焦虑障碍在内的多种神经精神性**发生有关。己有的Meta分析研究表明，焦虑障碍患者个体BDNF水平低于正常对照，但整体水平不一致，取决于检测的BDNF来源和患者焦虑类型。

      中医药在焦虑症的**中优势显著，但具体靶点和作用机制尚未完全明确。白香丹胶囊由白芍、香附和丹皮有效组分组成，临床**焦虑效果显著。本研究采用足底电击法诱发大鼠焦虑样行为，以国际通用的旷场实验和高架十字迷宫实验对各组大鼠行为学进行评价，采用ELISA法检测大鼠血清BDNF含量、Western blot检测大鼠脑区BDNF蛋白的表达，以探索焦虑症的相关病因，明确白香丹胶囊的相应疗效机制。

1材料

1. 1动物 健康雄性Wistar大鼠48只，体质量120- 150g，购自山东鲁抗实验动物中心[许可证号:SCXK鲁)20080002。动物于实验前7 d进入实验室以适应环境。室温20度，湿度50%一70 %。大鼠均饲养于昼夜颠倒环境，每日20:00开灯，8:00关灯。

1.2**及试剂 白香丹胶囊(BXD)，山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室自制，批号040201;地西洋片( DZP)，规格:片剂，每片2. 5 mg，**药。国药准宇H37023039，山东省平原制药厂出品。大鼠脑源性神经营养因子BDNFELISA试剂盒购自济南凯莱生物技术有限公司。BDNF  ( N一20)(兔抗人，*sc一546)一抗，p一actin(小鼠抗人，sc一81178)一抗和碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗兔)均购自关国Santa-Cruz公司;预染蛋白Marker ( PICPI26651)购自关国Thereto FisherScientific公司;ECL试剂盒(Z LI一9032)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他化学试剂主要购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1. 3主要仪器 大鼠旷场实验箱、大鼠高架十字迷宫(EPM) ，supermaze动物行为分析系统，均购自hth入口 ;ST一A数宇脉冲生物刺激仪(由济南空军后勤装配总厂、山东中医药大学联合研制);酶标仪(芬兰 Labsystems Multiskan MS，型号352型);洗板机(芬兰Thereto Labsystems，型号AC8);转印仪(Mini一protean3 165一3323.美国B io-Rad公司);微量高速离心机(国产，型号TG16W);

2方法

2. 1动物分组、造模及给药大鼠经1周适应期后进行旷场实验，选取旷场实验得分相近的40只大鼠进行实验，并随机分为4组，每组10只，即空白组、模型组、白香丹胶囊给药组(BXD组)、地西洋给药组(DZP组)。①空白组:不给予仟何刺激，正常饲养，每天给予无菌饮用水。②模型组:利用ST一A数字脉冲生物刺激仪，采用足底电击法诱发大鼠焦虑样行为，具体做法为:将拟造模大鼠置入可调式激怒、噪音、脉冲电刺激笼内，造模条件设定为白天2档(间隔时间为5min)，夜间3档(间隔时间为10 min)，中等强度电流0. 5 mA，电压2700一3300 v，脉宽0. 3s，刺激时间共12 d;造模的同时给予无菌饮用水。③ BXD组:按②造模，同时给予白香丹200 mg .kg -1 " d -1.灌胃给药12d  .DZP组:按②造模，同时给予地西洋1mg .kg -1.d-1 .灌胃给药12 d。造模完成后即采用旷场实验和高架十字迷宫实验对其行为学表现进行评价。

2. 2行为学测试实验室内只开红光灯，光线昏暗(以1. 5 m距离处能区分大鼠细微活动的*低亮度为宜)，保持恒亮，室温21℃，安静。测试箱放置于实验室的一角。

旷场实验:采用大鼠旷场实验对大鼠进行运动能力评价，操作者握住大鼠尾根部1 /3处，小心放入旷场中央，用摄像系统及supermaze动物行为分析系统记录大鼠3 min的行为变化，选取旷场运动总路径作为大鼠运动能力评价指标。

EPM实验:采用大鼠高架十字迷宫、摄像系统及supermaze动物行为分析系统记录大鼠5  min的行为变化进行大鼠焦虑状态评价，主要进行OE. OT. CE. CT四个指标的测定，并计算开放臂进入次数比例[COE%O，即OE/ (OE + CE)  x 100%」和开放臂停留时间比例COT%O，即OT /(OT+CT)  x 100%]。

2. 3ELISA实验和Western blot检测行为学测试结束后对各组大鼠断头取血，分离血清，用ELISA试剂盒检测血清BDNF水平。BDNF试剂盒(生产批号E- 30664)，购自厦门慧嘉生物科技有限公司。实验操作均按照试剂盒说明进行，*后用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠血清BDNF浓度。

行为学测试结束后大鼠迅速断头，取血，迅速剥离左海马(z）、右海马(Y)、额叶(E)、下丘脑(X)，提取总蛋白，Bradford方法蛋白定量。SDS - PAGE蛋白电泳，转膜，封闭。加入一抗(BDNF  1 : 500 ; Tubulin1: 1000 ) 4℃过夜或室温摇床孵育1 h，二抗(1:5000)室温摇床孵育1 h. TBST洗涤3次。ELL发光液显色，暗室曝光检测，用凝胶成像分析仪在可见光下对显色膜进行扫描和图像分析以BDNF /Tuhulin为BDNF蛋白的相对光密度值。

2. 4统计方法实验数据采用SPSS 17. 0统计软件分析，采用GraphPad  Prism 5. 0软件进行统计作图。多个样本均数比较用单因素方差分析，显著性水平为P<0.05.

3结果

3. 1BXD对大鼠旷场运动总路径的影响旷场实验结果显示，模型组大鼠旷场运动总路径高于空白组(p<0.01)，采用足底电击法成功诱发了大鼠焦虑样行为。BXD组和DZP组大鼠的旷场运动总路径低于模型组(P<0.01)，提示中药白香丹胶囊、西药地西洋均干预有效(见图1) 。

3. 2   BXD对大鼠EPM实验中OE% . OT%的影响EPM实验结果表明，模型组大鼠的OE /%和OT /%均低于空白组大鼠(P<0.01)，采用足底电击法成功诱发了大鼠焦虑样行为;;BXD组和DZP组的OE /%和OT/%均高于模型组(P <0.01)，提示中药BXD和西药DZP均能有效降低大鼠的焦虑样行为，见图2a和图2b。

3. 3   BXD对大鼠叙清中BDNF含量的影响ELISA实验结果显示，模型组大鼠的血清BDNF含量低于空白组大鼠(P<0.01);BXD组和DZP组大鼠血清的BDNF含量高于模型组大鼠(P<0.01)，提示中药BXD和西药DZP均能有效提高BDNF含量水平，结果见图3。

3. 4   Western blot检测大鼠各脑区BDNF蛋白表达水平模型组大鼠各个脑区(左海马、右海马、额叶、下丘脑)BDNF蛋白表达水平均低于空白组大鼠(P<0. 01) ; BXD组和DZP组大鼠的BDNF蛋白表达水平均高于模型组大鼠(P <0.05或P <0.01)，结果见图4a.4b和表1.

4讨论

      本研究前期曾采用不确定性空瓶刺激法建立焦虑大鼠模型，虽然成功造模，但由于该方法对大鼠饮水时间、次数的限制，后期采血比较困难等因素，对实验影响比较大，不利于深入研究。焦虑障碍本身存在着心身两方而的异常。足底电击法是一种基于条件反射的焦虑动物模型造模方法，既包含心理应激，也包含物理应激的成分，可有效模拟人类的焦虑反应，预测**抗焦虑活性。

    旷场实验和EPM实验是经典的检测焦虑反应的方法。旷场实验中运动总路程可反映大鼠的兴奋性,EPM实验原理是利用动物对新异环境的探究特和对高悬敞开臂的恐惧心理，形成动物的矛盾冲突来考察大鼠的焦虑状态，以OE%和OT%反映动物的焦虑状态。本研究焦虑模型组大鼠旷场实验运动总路径较空白组大鼠明显升高;模型组大鼠EPM测试中OE%和OT%较空白组大鼠明显降低，表明采用足底电击法成功诱发了大鼠焦虑样行为，造模成功。DZP组和BXD组大鼠运动总路径较模型组大鼠均降低、OE%和OT%较模型组大鼠均提高，说明中药白香丹胶囊和西药地西洋均可使模型组大鼠的焦虑样行为得到缓解，而且BXD抗焦虑作用效果要优于DZP.

    BDNF于脑内合成，是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肤，分子量为13. 15 kD，可透过血脑屏I漳。己有的临床实验发现，广泛性焦虑I漳碍患者的血清BDNF含量较正常人明显降低，帕罗西汀片**后显著性升高回。本研究结果显示，模型组大鼠血清BDNF水平显著低于空白组大鼠，与己有的临床实验报道一致，从另一方而证实模型制备成功;模型组大鼠各个脑区BDNF蛋白表达较空白组亦显著性降低，与血清检测结果一致，表明血清BDNF含量可反映脑内BDNF蛋白水平;DZP组和BXD组大鼠血清和各脑区BDNF水平较模型组升高，和空白组无明显差异，提示白香丹胶囊疗效与地西洋片相似，可有效改善BDNF水平。由此可见，BDNF是白香丹胶囊的作用靶点之

      白香丹胶囊由白芍、香附和丹皮的有效组分构成。己有的研究表明，白芍有效组分包括芍药有、牡丹酚、芍药花有等化学成分，主要有**、镇痛、**等药理作用[U al;香附有效组分为挥发油，对于**神经系统的作用主要为**、镇痛[Cisl;丹皮主要有效组分为丹皮酚，有显著的抗焦虑性行为作用[C ml。本实验证实白香丹胶囊具有显著的抗焦虑作用，根据己有的文献，可推测丹皮有效组分发挥重要抗焦虑作用，白芍和香附是否具有抗焦虑作用功效，或与丹皮发挥协同作用需要进一步的实验予以证实。动物实验也显示，以白芍为重要组分的四逆散和逍遥散可显著改善慢性应激模型大鼠海马BDNF表达降低[Cn-isl，白芍与熟地黄配伍亦可升高大鼠脑组织中BDNF水平09}，含有白芍、香附、丹皮的疏肝解郁饮可使抑郁模型大鼠血清BDNF水平明显回升Czol;细胞研究则表明丹皮酚可增加海马神经元BDNF的表达[。因此，可推断，白香丹胶囊可有效升高焦虑大鼠血清及脑内BDNF水平可能是白芍、香附和丹皮三者有效组分共同作用的结果，具体哪种组分起主要作用需要深入探索。

      综上，旷场实验高架十字迷宫对焦虑大鼠血清水平的影响，BDNF是其作用靶点之一。白香丹胶囊的哪些有效成分如何作用于BDNF，需要进一步探索。