摘　要: 　目的　 观察毁损黑质多巴胺能神经元大鼠行为学及其形态学变化特点, 探讨两者之间的相关性。 方法　利用62羟基多巴胺 (62OHDA ) 单侧一点注射大鼠黑质致密区 (SN c) , 特异毁损多巴胺 (DA ) 能神经元, 采用开野实验观察术后1d、 3d、 5d、 7d、 14d、 21d 行为学变化; 利用N issl 染色、H E 染色、**组织化学方法和电镜的方法, 观察各时间点黑质形态学变化。 结果　毁损侧DA 能神经元逐渐减少, 超微结构损伤逐渐加重; 开野实验中旋转、探究、后肢站立和穿梭行为在术后 1d 即有显著改变 (与对照组比较 P < 0. 05) , 其中, 旋转行为与毁损程度呈正相关 ( r=0. 471 , P < 0. 01 ) , 探究、后肢站立和穿梭行为与毁损程度呈负相关 ( r 分别为 - 0. 719、 - 0. 589、 - 0. 594, P <0. 01 ) , 修饰行为与毁损程度无相关性 (r= - 0. 227, P > 0. 05)。 结论　黑质DA 能神经元丢失是毁损大鼠行为改变的病理学基础, 开野实验可作为丢失程度的敏感行为学观察指标。
关键词: 行为; 　多巴胺; 　黑质; 　旷场实验

众多研究和临床实践表明, 脑内 DA 系统与动物的运动、学习、记忆、情绪等活动有密切关系。帕金森 病 (Park in son’ s disease, PD ) 就是原因不明的黑质DA 能神经元变性丢失, 导致纹状体内DA 释放量减少, 从而出现僵直、静止性震颤和运动障碍等症状, 并伴有痴呆发生。目前 PD 大鼠模型大多以**诱导的旋转实验作为建模成功与否的观察指标, 但此时黑质DA 能神经元丢失80% 左右, 纹状体DA 含量下降超过 90% , 相当于临床 PD 晚期 [ 1 ]。利用开野实验作为行为学观察指标, 动态观察黑质 DA 能神经元形态学变化与行为改变之间的关系, 相关报道还不多见。本实验利用 62OHDA 特异毁损大鼠单侧黑质DA 能神经元, 在不同时间点观察DA 能神经元的病理变化, 丢失比例和行为学改变, 分析两者之间的相关性, 以期为 PD 早期模型提供行为学评价指标, 为 PD 早期病理改变和神经生化研究提供指导。
1 　材料与方法
1. 1 　 仪 器 及 主 要 试 剂 　 脑 立 体 定 位 仪(hth入口 ) , 微量推进器 (N rish igeM O 281 日 本 产 ) , 图 像 分 析 系 统 ( 江 苏 捷 达) , 62OHDA (Sigm a)、酪氨酸羟化酶 (TH ) 抗体 (1 ∶ 500
Sigm a) , SABC、 DAB (武汉博士德)。
1. 2　实验动物及分组　健康 Sp rague2D aw ley雄性大鼠 60 只 (安徽医科大学实验动物中心提供) ,体重 210～ 240g, 随机分为正常对照组 (N C ) (n =10) , 实验对照组 (EC ) (n = 10) , 和实验组 (n = 40) ,后者按处死时间不同随机分成 4 组, 每组 10 只。
1. 3 6-OHDA 毁 损 　 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350mg/kg) 麻醉大鼠, 头颅水平位固定在脑立体定位仪上, 门齿沟平面比耳间线平面低2. 4mm , 剪去头部毛, 切开头皮, 暴露颅骨前囟点 (若不清晰, 可用3% H 2O 2 擦洗) , 参照包新民等 [ 2 ] 著《大鼠脑立体定位 图 谱》确 定 右 侧 SN c 区 坐 标 前 囟 后 (A P )- 5. 2mm , 右侧旁开 (R ) 1. 3mm , 深度 (V ) 8. 0mm ,颅骨钻孔后 (切勿损伤软脑膜) , 1ul 微量注射器插入右侧SN c 区, 注射8g/L 6-OHDA (溶于0. 2%V itC 生理盐水溶液) 1ul, 利用微量推进器缓慢推进 (0. 5ul/m in)。注射完毕, 留针5m in 后缓慢拔针, 缝合皮肤并肌注硫酸庆大霉素 (5mg/kg) 预防感染, 清醒后置笼喂养。 EC 组仅注射0. 2%V itC 生理盐水溶液1ul, N C组不手术。
1. 4　开野实验 /旷场实验(open-field test) [ 3 ]  旷场箱100cm × 100cm × 40cm , 采用hth华体会官网com 动物行为学软件进行视频分析，箱底划为 25 个方格 (20 cm × 20cm ) , 将大鼠放入正中一格, 再点击软件开始记录 15m in 内各项行为指标。 在毁损术后1 d、 3d、5d、 7d、 14d、 21 d 各观察 1 次, 每次实验均在 7: 00～12: 00AM 进行, 实验室内暗光、安静, 两次实验之间将箱底打扫干净。

1. 5　形态学观察
1. 5. 1 　取材　分别在术后 1d、 7d、 14d、 21 d 行为学测试完毕, 7% 水合氯醛 (ip , 350mg/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盘上, 打开胸腔, 暴露心脏, 先用 0. 9%N aC l 100m l 经心脏冲洗, 然后300m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出脑组织4% 多聚甲醛后固定24h。在针道旁 冠状面切开, 石蜡包埋, 连续切片, 片厚 6um , 常规H E 染色。定位不在 SN c 区的大鼠从该组剔除, 不进行统计学分析。
1. 5. 2 N issl 染色　切片脱蜡至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15～20min, 95% 酒精快速分色 (2～ 3 s 即可) , 脱水、透明、封片、镜检。
1. 5. 3　**组织化学染色 (ABC 法) 　切片脱蜡至水后经 3% H 2O 2 灭活内源性过氧化物酶, 微波抗 原修复 2 次, 正常山羊血清封闭 20m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育过夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20m in。 其间, 各步骤间均用0. 01m o l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗涤, *后加 DAB 显
色 (镜检控制显色时间 ) , 常规脱水、透明、封片、镜检。
1. 5. 4　电镜观察　灌注固定后, 分离黑质和纹状体约 1mm 3, 2. 5% 戊二醛、 1% 锇酸双重固定, 脱水, Epon812 包埋, L KB 2NOVA 切片机超薄切片,醋酸铀枸橼酸铅双重染色, 日产JEM 21230 型透射电镜观察。
1. 5. 5　图像分析　采用江苏捷达图像分析系统对切片进行图像分析, 根据N issl 染色圈出黑质范围, 采用同一放大倍数 (× 100) , 同一光强度下测量阳性数密度, 并按照公式: 100- (右侧细胞数/左侧细胞数) × 100, 计算DA 能神经元毁损程度。
1. 5. 6　统计方法　所有数据采用 X ± s 表示,SPSS11. 5 统计软件进行分析, 采用单因素方差分析(ANOVA ) 进行组间比较, *小有意义差异 t 检验(L SD 2 t) 进行组内两两比较, 开野实验各参数与黑质DA 能神经元毁损比例作 Pearson’ s 相关分析。
2　结　果
2. 1 　开野实验结果　见表  (1 ) 旋转行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 05)。 在术后 1 d 右侧旋转行为增多 (与对照组比较 P < 0. 05) , 3d、 5d 恢复到对 照组水平 (P > 0. 05, 与 1 d、 14d、 21 d 组比较 P <0. 05 ) , 而后右侧旋转又逐渐占据优势 (14d、 21 d 组与对照组比较 P < 0. 05) ; (2) 探究行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01 )。 术后 1d 较对照组大幅减少(P < 0. 01 ) , 3d、 5d 接近对照组水平 (P > 0. 05, 与1d、 7d、 14d、 21 d 组比较 P < 0. 01 ) , 此后逐渐降至较低 水平 (与对照组比较 P < 0. 01 ) ; (3) 穿梭距离: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01 )。 实验组变化趋势呈正态分布, 1d、 14d、 21d 组与 5d 组及对照组比较差异有显著性 (P < 0. 01 ) , 5d 组与对照组比较差异无显著性 (P > 0. 05) ; (4) 下肢站立: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01 )。 各实验组与对照组比较差异均有显著性 (P < 0. 01 ) ,3d、 5d 组也有恢复倾向 (与 1d、21 d 组比较 P < 0. 05) , 但与对照组相比仍处于较低水平; (5) 修饰行为: 变化没有规律性, 组间比较差异无显著性 (P > 0. 05)。
2. 2　形态学观察结果　见表 2。 (1 ) H E 染色和N issl 染色显示, 从 1 d～ 21 d 大鼠 62OHDA 注射侧SN c 区神经元较对侧明显减少, 尼氏体着色较对侧淡, 针道及毁损区可见不同程度胶质细胞浸润, 对照组左右侧细胞数均无明显变化。 (2) **组化染色显示 (见图 1～ 图 5) , TH 阳性神经元随时间推移逐渐减少, 毁损比例不断增大, 没有恢复倾向, 对照组无明显变化。 (3) 电镜结果见图 6～ 图 8, 从1～ 21 d 大鼠黑质神经元超微结构损伤逐渐加重, 线粒体肿胀、嵴消失, 粗面内质网和高尔基体也有肿胀; 21d 神经元水肿, 游离核糖体减少, 溶酶体增多; 在纹状体则有髓鞘松解断裂, 突触小泡多为清亮型, 颗粒小泡极少甚至看不见。
2. 3 　相关分析结果　旋转行为与黑质 DA 能神经元毁损比例呈正相关 ( r= 0. 471, P < 0. 01 ) ; 探究行为、穿梭距离、下肢站立行为均与毁损比例呈负相关 ( r= - 0. 719、 - 0. 594、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修饰行为与毁损比例无相关性( r= - 0. 227, P > 0. 05)。

3　讨　论
DA 作为内源性神经递质作用于基底核 (basalganglia) 的D 1、 D 2 受体, 平衡调节基底核为中心的直接和间接神经回路功能。 基底核并不发布对肌肉收缩的命令, 而是通过选择不同的神经元发放电活动,参与随意运动的程序编制和运动程序的执行, 在调节运动的组成、方向、顺序、速度和幅度等方面发挥其作用。 PD 由于 SN c 区DA 能神经元退变, 导致纹状体DA 含量下降, DA 对间接回路的去抑制和对直接回路的兴奋两种功能严重丧失, 导致运动障碍。本实验的结果也显示, 实验组大鼠在毁损术后 1 d 即有明显行为学改变, 其中旋转、探究、后肢站立和穿梭行为与黑质DA 能神经元丢失比例有很好的相关性,而正常对照组和实验对照组大鼠的行为在实验前后没有明显改变。
脑内 DA 神经系统具有一定的代偿功能, 如 PD患者在出现临床症状时 SN c 区DA 能神经元丢失已达80% 以上, PD 模型大鼠由于DA 受体超敏出现DA激动剂诱导的旋转运动等。 在我们的行为学实验中也观察到这种代偿现象, 开野实验的旋转、探究、后肢站立和穿梭行为指标在术后 3d、 5d 有趋于改善的倾向, 其可能机制 [ 4～ 8 ]: (1 )DA 更新率增加, 残存的DA 能神经元合成和释放DA 的能力增强; (2)DA 受体超敏, 包括受体敏感性增强和受体数目的增加;(3) 信号转导效率的增强, 如 Gs 蛋白上调, A C 酶活力提 高, 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶 (ex tracellu larsignal2 regu lated k inase, ER K) 的活化等。 我们的实验未发现修饰行为与黑质毁损比例有相关性, 但Berridge [ 9 ] 指出纹状体在修饰行为的整合中起重要作用 , 如果毁损双侧纹状体前外侧部, 则将打破修饰行为链。因此, 我们认为毁损一侧SN c 区只能导致一
侧纹状体DA 含量下降, 而健侧纹状体足以发挥代偿作用 , 保持修饰行为链的完整性。 另外, 可能与环境变化、手术损伤、麻醉等外界因素和观察时间不够也有一定的关系。6-OHDA 即 2. 4. 52三羟基苯乙胺, 是一种选择性儿茶酚胺能神经元化学毁损剂, 单独或联合注射到大鼠 SN c、内侧前脑束 (M FB )、纹状体 (Cpu)、腹侧被盖区 (V TA ) 等不同脑区, 选择性地毁损DA 和N E能神经元 (尤其对前者作用更显著) 制作不同程度损害的 PD 模型 [ 10 ]。其作用机制是: 62OHDA 通过多巴胺转运体进入DA 能神经元, 快速氧化生成氧自由基
(O 2 - 和 · OH ) , 抑制线粒体氧化呼吸链复合物É , 并激 活 caspase 启动细胞凋亡, 从而导致黑质 DA 能神经元丢失 [ 11, 12 ]。在我们的实验中,6-OHDA SN c 区注射后 24h 即有 50% 以上的DA 能神经元丢失, 而后随时间推移毁损比例不断增大。**组化切片经N issl复染发现, 非DA 能神经元形态完整, 数量并不减少,在早期甚至有增多现象, 这说明 62OHDA 是一种实用可靠的特异性DA 能神经毒剂。但该法制作的模型仍属于急性损伤完全毁损模型, DA 神经元在注药后4h 即可见丢失。若用**诱导旋转实验作为鉴定标准, 一般为术后 2～ 3 周阳性, DA 神经系统毁损已相当严重, 不利于观察轻中度毁损模型。 许多研究指出 , 对轻中度毁损模型的研究更有助于对临床 PD 早期患者病理形态、神经生化和轻度行为异常的了解,有 助于 PD 病因、发病机制和**、细胞移植及基因**的研究。因此, 建立一个敏感反映轻中度毁损的行为学观测指标, 具有较大的现实意义。我们利用开野实验对毁损早期的大鼠进行行为学的观察, 发现术后 1 d 各项指标即已发生明显改变, 并能很好地动态反映DA 毁损程度。开野实验不仅适用于轻中度毁损模型的观测, 还能反映毁损早期机体的代偿情况,并且各参数间可相互佐证, *大程度地减少主观因素的影响。因此, 我们认为开野实验是一个很好的反映DA 神经系统毁损程度的行为学观察指标。