摘 要 目的:用脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 建立阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 炎症模型大鼠，观察淫羊藿苷( Icariin ICA) 对该模型大鼠学习记忆及超微结构的影响。方法: 经八臂迷宫训练成功的 45 只雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组、模型组、淫羊藿苷 30mg/kg 组、淫羊藿苷 120mg/kg 组、双氯芬酸组10mg/kg 组，采用侧脑室注射 LPS( 10μl) 制作实验性 AD 炎症模型，并八臂迷宫测验并记录其数据。迷宫测验完成后断头取脑海马组织。应用电镜观察大鼠海马组织CA1 区神经细胞超微结构变化，用 SPSS 统计学软件进行统计学分析。结果: ⑴侧脑室注射 LPS( 10μl) 后对大鼠一般情况观察出现了行为异常。⑵八臂迷宫测试系统分析结果: 制模后与对照组相比，其它各组大鼠总记忆错误( TE) 、参考记忆错误( ＲME) 、工作记忆错误( WME) 明显增多，用淫羊藿苷**后与模型组比较，淫羊藿苷 120mg/kg 组和双氯芬酸组 10mg/kg 组大鼠的 TE、ＲME、WME 均明显减少，淫羊藿苷 30mg/kg组错误选择次数无统计学意义。超微结构观察示: 对照组、海马组织线粒体比较规则，淫羊藿苷 120mg/kg 组、双氯芬酸组线粒体轻度受损，模型组海马神经细胞核固缩，核周隙扩张，甚至核膜结构不清，核形态极不规则。结论: 侧脑室注射LPS( 10μl) 能成功复制AD 炎症动物模型; 淫羊藿苷 120mg / kg 组显著改善 AD 模型大鼠的学习记忆能力，淫羊藿苷对炎症模型大鼠海马超微结构有保护作用。

关键词 淫羊藿苷; 阿尔茨海默病炎症模型; 电子显微镜; 超微结构

阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种常见的**神经系统退行性**，表现为进行性的记忆和认知功能的下降，行为异常和社交障碍。其发病机制有很多学说，其中炎症机制受到广泛关注。众多研究表明****是**阿尔茨海默病的一种潜在**方案并研究提示**可改善 AD 病理改变。应用脂多糖可诱导阿尔茨海默病炎症模型大鼠模型。淫羊藿甙具有**，抗氧化等多种生物学活性。基于以上理论，联系阿尔茨海默病的炎症机制和淫羊藿的**作用本实验目的是建立脂多糖诱导的 AD 炎症模型大鼠，通过八臂迷宫测验淫羊藿苷对该模型大鼠学习记忆能力的影响，用电镜观察海马组织 CA1 区的超微结构并探讨及其作用机制。

1 材料与方法

1． 1 试验** 淫羊藿苷 ( ICA) 西安小草植物科技有限责任公司，批号: XC071223，纯度 ＞98% ( HPLC) 。

1． 2 动物 普通成年雄性 Wistar 大鼠 45 只，体重 220 ～ 280g，购自内蒙古大学实验动物中心，均为清洁级动物，动物合格证号为: SCXK( 蒙) 2002-0001 ，分组分笼饲养，充分光照，每 12 小时明暗交替，( 光照时间: 8∶ 00 ～20∶ 00) 控制室温 18-21℃ ，标准饲料喂养，自由饮食，使其体重控制在自由进食体重的 80%～ 85% 。适应性喂养 3 天。

1． 3 试剂 脂多糖 ( LPS) 美国 SIGMA 公司，批号: 127K4048货号: L2880。

1． 4 仪器 八臂迷宫分析测试系统( hth入口 ) ，脑立体定位仪( hth入口 ) ，H-600 型透视电镜( 日本株式会社产品)

1． 5 方法 八臂迷宫动物空间记忆测试是研究认知功能机制的*常用方法之一，本研究也采用放射状八臂迷宫( 四臂放食物) 训练 Wistar 大鼠，以建立一种有效评价淫羊藿对大鼠空间记忆影响。在进行放射状八臂迷宫实验前限制大鼠禁食，不限制饮水，维持其体重原体重的 80% ～ 85%。行为学观察均在10∶ 00 ～ 17∶ 00 进行。训练前大鼠先在迷宫中适应 2 d，每天2 次。适应时 3 ～ 4 只大鼠同时置于迷宫中，自由活动和摄取食物 10 min。适应后进行每天 2 次的训练。每次训练中，八臂中只有四臂放置了食物( 分别为 1、3、4 和 6 号臂) ，整个实验过程均维持此顺序。大鼠放在迷宫中央区，此时中央区四周用门关住 15 s 将门打开，大鼠可选择进入任意一臂摄取食物，测试定时3 分钟。大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为 1 次正确选淫羊藿苷对阿尔茨海默病炎症模型大鼠神经细胞的保护作用择，否则为错误选择。记录参数为错误选择的次数。重新进入放食物臂称工作记忆错误( working memory error，WME) ，进入不放食物臂称为参考记忆错误( reference memory error，ＲME) 。两者之和为总记忆错误( total error，TE) 。连续 5 次训练总错误选择次数为1 次或1 次以下，认为训练成功。ＲM-200 八臂迷宫分析测试系统采用红外探测的方式跟踪大鼠的行为，采用微电脑控制，可自动得出测定结果。八臂迷宫训练成功的 Wistar 大鼠 45 只随机分为 5 组，分别为对照组、模型组、淫羊藿苷 30mg/kg 组、淫羊藿苷 120mg / kg 组、双氯芬酸钠 10mg / kg 组，每组淫羊藿苷对阿尔茨海默病炎症模型大鼠神经细胞的保护作用

Wistar 大鼠 9 只。大鼠八臂迷宫训练成功后次日通过侧脑室注射 LPS 溶液诱导 AD 炎症模型，具体方法如下: 3% ****钠40 ～ 50mg / kg 腹腔注射，麻醉大鼠，将鼠头固定于脑立体定位仪上保持前后囱在同一水平，剪开头顶部毛发，碘酊**后切开皮肤，按照 George Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》进行定位，选择右侧侧脑室为注射靶区在前囱点后方 1． 0 mm，中线旁开 1．6mm，用柔性颅骨钻钻一小孔，用微量注射器缓慢自脑表面垂直进针深度为 3． 4mm( 达侧脑室) ，将 5ug/ul LPS 溶液 10μl 缓慢注入，留针 2min 后缓慢撤针，缝合切口。对照组注入等体积无菌性生理盐水。造模后**天始用药结束止分别通过八臂迷宫实验观察大鼠的空间记忆能力，以判定模型的成败和**的疗效。八臂迷宫测试系统记录分析大鼠的 ＲME 、WME、TE 每只大鼠测试两次，取平均值进行统计分析。

1． 5． 1 给**法

对照组: 大鼠侧脑室注射生理盐水后次日起，蒸馏水连续灌胃 14 天，方法为用灌胃针将蒸馏水按 1ml/100g( 大鼠体重) 灌入大鼠胃内，1 次 / d; AD 模型组: 大鼠 AD 模型制备后次日起，蒸馏水连续灌胃 14 天，方法同上，1 次/d; 淫羊藿苷 30mg/kg 组: 大鼠 AD 模型制备后次日起淫羊藿苷30mg / kg，连续灌胃 14 天，方法为用灌胃针将淫羊藿苷混悬液( 配制 ICA 浓度为 0． 3%) 1ml/100g 灌入大鼠胃内，1 次/d; 淫羊藿苷 120mg/kg 组: 大鼠 AD 模型制备后次日起，淫羊藿苷120mg / kg 连续灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 双氯芬酸组: 大鼠AD 模型制备后次日起，双氯芬酸钠( 配制双氯芬酸钠浓度为 0．1% ) 10mg / kg 连续灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 双氯芬酸钠给药剂量参照人的给药剂量，按体重、体形系数算出。八臂迷宫测试完成后 24h 内用 2% ****钠腹腔麻醉( 40 ～50mg/kg) 快速取脑后分离海马组织，液氮保存。

1． 5． 2 电镜标本的制作及大鼠海马超微结构的观察 每组随机选取 3 只大鼠，10% 水合氯醛麻醉后，快速取脑，并将取出的脑组织置于冰上，分离海马，3% 戊二醛中 4℃ 冷藏，经过清洗、后固定、脱水、浸透、包埋聚合，光镜下定位 ，选取海马 CA1 区富含神经元部位制成超薄切片( 70nm) ; 经醋酸铀电子染色剂染色后置于透射电镜下观察并拍照。淫羊藿苷对阿尔茨海默病炎症模型大鼠神经细胞的保护作用

1． 6 统计学处理 采用 SPSS 13． 0 统计软件进行统计分析。描述性资料以( x ± s) 表示，计量资料经齐性检验方差齐采用单因素方差分析，组间比较用 LSD 法，检验水准 a =0． 05。

2 结果

2． 1 一般情况观察 模型组与其它组比较，大鼠活动减少，体毛少泽，神情呆滞，反应欠灵，食欲减退。

2． 2 八臂迷宫实验结果

制模前每只大鼠的总记忆错误≤1，分组并制模后与对照组比较其它各组大鼠记忆能力明显减低，总记忆错误、参考记忆错误、工作记忆错误显著增多，表明侧脑室注射脂多糖后大鼠的记忆能力明显受损，阿尔茨海默病模型制作成功。**后与模型组比较，淫羊藿苷 120mg/kg 组和双氯芬酸组总记忆错误、参考记忆错误、工作记忆错误显著减少，淫羊藿苷 30mg/kg 组总记忆错误、参考记忆错误、工作记忆错误无统计学意义，淫羊藿苷 120mg/kg 组和双氯芬酸组比较总记忆错误、参考记忆错误、工作记忆错误无统计学意义。

2． 3 电镜观察海马超微结构结果 对照组大鼠海马区神经细胞线粒体规则，核呈圆形或椭圆形，核膜双层结构清晰，核内染色质分布均匀，可见核孔、单个或两个核仁，细胞质内含各种细胞器及包涵物、排列有序。线粒体大小及形态正常，内嵴清晰可见，基质均匀，粗面内质网散在分布，神经毡内突触结构正常。见图 1，2。淫羊藿苷 30mg/kg 组神经细胞损伤较重，线粒体嵴断裂，呈空泡化改变，胞质内可见脂褐素颗粒沉积，但核膜清楚，见图 3，4 。模型组可见大鼠海马 CAI 区神经细胞严重损伤，稀疏少见，神经细胞形态不规则，变形，胞膜皱缩，胞体缩小，胞浆浓缩，细胞器稀疏，线粒体数目明显减少，线粒体靖排列紊乱，甚至断裂消失，神经细胞核固缩，核膜结构不清，核形态不规则，有切迹，核偏位，线粒体肿胀，可见嵴断裂，空泡形成。见图 5，6。淫羊藿苷 120mg/kg 组大鼠海马内神经细胞损伤较轻，为神经元胞体较大，核圆，核膜清晰，核仁明显; 胞质内细胞器较丰富; 排列有序，神经毡内突起结构正常，突触数量较多。见图 7，8。双氯芬酸组大鼠海马内结构基本正常，突触前膜内突触小泡较清晰 ，神经细胞内细胞器较多，排列较整齐。

3 讨论

3． 1 阿尔茨海默病的验证机制及淫羊藿苷的**作用 据报道炎症与阿尔茨海默病的发病有关。在阿尔茨海默病患者脑中，Aβ 肽可引起炎症反应而致神经元丧失和认知功能障碍。研究证实 Aβ 可激活胶质细胞而引起炎症反应。体外研究发现，激活的胶质细胞可通过炎症介质，如白细胞介素 1( IL-1) 、化学因子及神经**物质而引起神经毒作用。IL-1 也可进一步引起其他神经因子的表达，如白细胞介素 6( IL-6)。在

胶质细胞和神经元内，有与炎症有关的酶，如 P38 分裂素激活蛋白激酶( p38mitogen-activated protein kinase，p38 MAＲK) 和环氧化酶 2( cyclooxygenase-2，COX-2) 可被激活而导致神经元损害。尸检已证实，在 AD 患者脑中存在参与炎症过程的补体蛋白、细胞因子及蛋白酶。还有研究发现脑部淀粉样蛋白周围的炎症减轻使神经元存活率明显上升。

迄今为止，AD 尚无特效**方法和**。目前** AD 的主要**包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、脑细胞代谢激活剂、脑血循环促进剂、神经营养药、雌**以及抗氧化剂等。****源于 AD 的炎症假说。*近研究显示 tao 蛋白及神经炎症反应在AD 发病中占有重要地位，并把神经炎症机制作为防治 AD 的重要靶点。

流行病学资料表明长期用 NSAIDs 能降低 AD 发生的危险性，由于长期服用甾体类**药副作用较大且对患者的记忆力有损害，这就限制了广泛用于预防 AD 的应用。所以既有**作用，副作用又小的**是当前研究的焦点。本实验应用NSAIDs 双氯芬酸钠作为对照组发现淫羊藿苷 120mg / kg 组与双氯芬酸钠作用相当，并淫羊藿苷是传统中药副作用小，对其作用的机制可能也是**作用，本实验根据炎症机制给大鼠侧脑室注射 LPS 诱导产生 AD 炎症模型。并用八臂迷宫测试系统测试后结果与对照组比较模型组 WME，ＲME，TE 显著增高;表明比较成功的复制了 AD 炎症模型。淫羊藿是一种**有效的天然****，其部分机制是可能的多重联系的亲炎症细胞因子的干预( 肿瘤坏死因子-α 和 IL -6) ，炎症介质( NO) 和粘附分子( 表面 CD11b) 。近期国外对淫羊藿苷的研究表明淫羊藿苷可保护 LPS 诱导的软骨细胞炎症和细胞外基质降解。

3． 2 淫羊藿苷对海马超微结构的影响 1931 年德国科学家研制出了世界上**台透射电子显微镜，为人类认识细胞的超微结构奠定了基础。细胞超微结构的观察，对于研究**的病理生理变化有着非常重要的意义。为了更深入的了解 AD 的病理变化，我们选用透射电镜观察该模型海马 CAI 区神经细胞超微结构的变化。通过观察发现，对照组线粒体形态结构基本正常。( 见图 1，2) 羊藿苷 30mg/kg 组和模型组，大鼠海马 CA1 区神经细胞器的结构均表现出不同程度的损伤，尤其以线粒体的肿胀、空泡化、可见嵴断裂，空泡形成，粗面内质网扩张、脱颗粒为突出表现，而这种损伤改变以 模型组更为严重淫羊藿苷 120mg/kg 组和双氯芬酸组与对照组相比较，线粒体的结构也有轻度的损伤。但细胞器丰富，排列规则。推测大鼠的学习记忆能力的下降很可能是由于神经细胞受到损伤间接造成的。而淫羊藿苷 120mg/kg 组可有效保护及修复神经细胞超微结构。

本实验用脂多糖成功复制出阿尔茨海默病炎症模型大鼠，淫羊藿苷**后用电镜观察其超微结构显示淫羊藿苷对炎症模型大鼠有很好的保护作用，其机制是否是**有关目前尚未证实，这将是我们下一步工作的重点。