前 言

    重复经颅磁刺激(rTMS)是一种无损伤的物理**方法，目前已逐渐得到人们关注，在临床主要用于精神神经系统**的**，可以改善神经系统退行性**的相关症状，如减轻帕金森病相关非运动症状，改善抑郁程度，调节阿尔兹海默病人的认知功能。研究表明，长期的高频 rTMS还可以抑制正常老化过程中的认知功能降低。研究还指出，rTMS 可以通过多通路，网络化的方式来改善个体的脑组织结构和功能并提高个体的认知功能。

    脑老化是指老化过程中伴随的脑组织结构和功能的变化。在健康个体，随着年龄的增长，脑老化的进程的发展，健康个体的认知功能也可表现为学习记忆能力的降低。而且在老化过程中，老化的脑组织也更容易患有神经系统退行性**。啮齿类动物作为实验模型研究脑老化及老化相关的认知功能障碍具有很多优点，例如，与人类相似，啮齿类动物的海马和前额皮层在老化中也是非常容易受损伤的，表现为脑组织结构和功能的变化。已有研究报道，昆明小鼠在老化过程中可表现出学习记忆能力的下降，可以作为研究脑老化的理想动物模型。在对啮齿类动物进行认知功能的评估中，被动逃避反应和新物体识别实验是经典的认知行为学检测工具。

因此，本部分实验应用昆明小鼠为研究对象，观察昆明小鼠在老化过程中的何种程度会出现认知功能损伤，并观察 rTMS 是否可以改善老化引起的认知功能障碍。

材料与方法

1 实验材料

1.1 主要实验仪器

磁刺激仪器、被动逃避反应箱、新物体识别箱 （购自hth入口 ）   

1.2 药品及试剂

75%酒精 天津市永大化工实验厂

2 实验分组及程序

动物分组及方法：3-4 月龄昆明小鼠，9-10 月龄昆明小鼠，16-17 月龄昆明小鼠。在实验室恒温 20-25 摄氏度饲养，然后用于实验。

实验分组，将昆明小鼠为以下 4 组：

（1）老年 rTMS 组：16-17 月龄老年小鼠，磁头于小鼠的颅顶部每天进行 10 组频率为 25 赫兹的磁刺激，总共刺激脉冲个数为 1000 个，连续14 天。

（2）老年 sham 组：16-17 月龄老年小鼠，以磁头反面于小鼠颅顶部进行与 rTMS 组相似的无功能的磁刺激。

（3）成年组：9-10 月龄成年小鼠，与老年 sham 组小鼠刺激方式相同。

（4）青年组：3-4 月龄青年小鼠，与老年 sham 组小鼠刺激方式相同。

各组动物在相同环境下饲养，然后进行为期 14 天的 rTMS 或者假刺激，刺激结束后通过被动逃避反应箱实验和新物体识别箱实验测试其学习记忆能力的改变。

3 被动逃避反应实验

在连续 14 天的 rTMS 或 sham 磁刺激后的**天，应用被动逃避反应实验对昆明小鼠进行认知功能测试。被动逃避反应实验装置是一个不透明塑料箱（箱体为 18 cm × 12 cm × 12 cm），箱内靠近一侧箱体放置有一个绝缘塑料平台(直径 5 cm；高 4.5 cm)。箱底由直径 0.2 cm 间隔 1 cm 的铜栅构成，铜栅可通电。

**天为适应性训练，将小鼠面对箱体侧壁放置于平台上，任其在箱内自由活动，适应训练时间 300 s。小鼠会在放入箱内后的一个很短的时间内跳下窄小，升高的平台，记录这一时间。实验的**天进行认知训练，即在适应训练 24 h 后：箱底通电(36 mV)，将小鼠面对箱体侧壁放在平台上，小鼠跳下平台即被电击，返回平台，认知训练 5 min 后取出小鼠，记录小鼠跳下平台被电击次数作为认知功能指标。实验第三天进行记忆检测，即在认知训练 24 h 后：箱底通电，将小鼠面向箱体侧壁放在平台上，记录小鼠**次跳下平台的时间即逃避潜伏期，作为**个认知功能指标，如果在 300 s 内小鼠都不跳下平台，则逃避潜伏期记为 300 s。以电击次数和逃避潜伏期反应小鼠认知功能。

4 新物体识别实验

每一只小鼠被单独放入一箱体内(30×30×30 cm)。箱体内放有两个不同物体，并间隔 15 厘米。在实验**天，每只小鼠在箱体内自由适应 20分钟。1 小时后，其中一个物体被一形状不同的新物体所替换，将小鼠放入，观察并记录 5 分钟内小鼠触碰两个物体的时间。24 小时后，另一个物体被另一个形状不同的新物体所替换。观察并记录 5 分钟内小鼠触碰两个物体的时间。实验过程中每只小鼠进行完一部分实验后用酒精擦拭实验箱消除**气味对测试成绩的干扰。在新物体识别测试中反应认知功能的指标被称为认知指数，即小鼠触碰新物体的时间与小鼠触碰两个物体时间总和的比值。因为啮齿类动物具有探索新事物的本性，认知指数的增长可以反应认知功能的提高。

5 统计学处理

采用 SPSS 16.0 软件进行统计处理，数据以均数±标准差（mean±SEM）表示。应用 one-way ANOVE 统计分析方法对实验数据进行分析，以 P<0.05 为有统计学意义。

结 果

1 新物体识别实验成绩的改变

1.1 老化过程中新物体识别成绩的下降

在 1 h 时间点，小鼠触碰两物体的总时间在青年组、成年组和老年组之间没有明显差异(Fig. 1A)，在 24 h，小鼠触碰两物体的总时间在三组之间也没有发现显著差异(Fig. 1 B)。在 1 h 时间点青年组和成年组小鼠之间的认知指数没有明显差异，与青年组和中年组相比，老年组小鼠的认知指数显著降低(Fig. 2)。同样在 24 h 时间点，与青年和中年组相比，老年组小鼠的认知指数显著降低，而青年组和中年组小鼠之间没有显著差异。1.2 rTMS 显著改善了老年小鼠的新物体识别实验的成绩。

在 1 h 时间点，小鼠触碰两物体的总时间在老年组和老年 rTMS 组没有明显差异(Fig. 1A)，同样在 24 h，小鼠触碰两物体的总时间在两组之间也没有发现显著差异(Fig. 1 B)。在 1 h 时间点老年组和老年 rTMS 组小鼠之间的认知指数没有明显差异，与老年组相比，老年 rTMS 组小鼠的认知指数显著提高(Fig. 2)。同样在 24 h 时间点，与老年组相比，老年 rTMS组小鼠的认知指数显著提高。

2 被动逃避反应实验成绩

2.1 老化过程中被动逃避反应成绩的改变

被动逃避反应实验适应阶段的潜伏期在青年组、成年组和老年组之间没有显著差异(Fig. 3)。与青年组和中年组相比，学习阶段的电击次数在老年组昆明小鼠明显增多(Fig. 4)，而青年组和成年组小鼠学习阶段的电击次数无显著差异。与青年鼠和成年鼠相比，记忆阶段的被动逃避潜伏期在老年组小鼠显著缩短，同样青年组和成年组之间记忆阶段的被动逃避潜伏期没有显著差异(Fig. 5)。上述结果表明，昆明小鼠的认知功能在 16 月龄时出现了损伤。重复经颅磁刺激改善老化引起的认知功能障碍

2.2 rTMS 显著提高了老化过程中被动逃避反应成绩

被动逃避反应实验适应阶段的潜伏期在老年组和老年 rTMS 组小鼠之间没有显著差异(Fig. 3)。与老年组相比，学习阶段的电击次数在老年rTMS 组昆明小鼠显著减少(Fig. 4)。同样与老年组小鼠相比，记忆阶段的被动逃避潜伏期在老年 rTMS 组小鼠出显著增长(Fig. 5)。上述结果表明，rTMS 可以改善昆明鼠在老化过程中出现的认知功能损伤。

讨 论

脑老化过程中伴随着脑组织结构和功能的改变，老年个体并表现出认知功能的下降。前额皮层和海马是学习记忆的关键**，是在年龄增长过程中也是*易受损伤的脑区。因此，与此部分脑区相关的学习记忆能力也会伴随着年龄的增长而出现损伤。啮齿类动物因其应用广泛，是对认知功能进行研究的良好的动物模型，可用于探讨认知功能改变的内置分子生物学机制。与人类相似，啮齿类动物的学习记忆能力在老化过程中出现了下降，并且伴随着前额皮层和海马相关脑区的学习记忆能力的损伤。

因此，应用啮齿类动物进行实验，研究老化过程认知功能受损的具体机制具有非常重要的意义。啮齿类动物学习记忆的变化可以应用行为学测试方法进行检测。被动逃避反应实验和新异物体识别实验是检测啮齿类动物认知功能的经典认知行为学测试方法并可检测与额皮层和海马区密切相关的认知功能。昆明小鼠是我国*常用的实验动物模型，具有可操作性强、价格低等优点。因此本实验采用昆明小鼠进行的研究，观察小鼠在老化过程中认知功能的变化，我们的研究结果与已有的研究报道相似，昆明小鼠在老化过程中出现了增龄相关的认知功能障碍。在本课题中我们分别应用了跳台被动逃避实验方法从动物的被动学习能力，新异物体识别方法对动物的天性偏爱记忆进行了观察，发现老化过程中昆明小鼠的被动和主动学习记忆能力都受到了损伤。我们首先证明了昆明鼠在 9 月龄时的认知功能没有发生变化，而小鼠的认知功能的减低出现在 16 月龄。重复经颅磁刺激改善老化引起的认知功能障碍

rTMS 是一种**、非侵入性的物理**方法。目前在临床得到广泛应用，在神经精神系统**的预防和**中具有良好的效果。在神经系统退行性**的**中的应用也逐步得到人们重视。研究表明 rTMS 可以改善正常老化过程中的学习认知功能降低。rTMS 可以调节神经元突触可塑性，改善长时程增强（LTP）现象。研究报道应用高频的 rTMS 在改善动物 LTP 的同时可以提高其新物体识别的成绩。在我们的研究中同样发现，rTMS 可以改善老化过程中昆明小鼠的被动逃避反应成绩和新物体识别实验成绩。为进一步探讨 rTMS 改善正常老化过程中认知功能损伤的深入机制选择了一种较为理想的动物模型。

小 结

昆明小鼠的认知功能在青年组和成年组没有出现明显差异，而在 16月龄时开始出现下降，而应用 rTMS 可以改善老化引起的认知功能损伤。