一、实验目的

（1）本实验通过进行穿梭，跳台，避暗，高架十字迷宫，旷场，悬尾，强迫游泳等实验来研究松树皮提取物在改善学习记忆，抗焦虑，抗抑郁等方面的功效。

（2）研究松树皮提取物对小鼠行为学方面的影响，为松树皮提取物的进一步研究和应用提供实验依据实验材料。

二、实验材料 

动物：  ICR 小鼠40只，重量( 20±2) g

     仪器：  小鼠行为学仪器（穿梭仪，避暗仪，高架十字迷宫（型号XR-XG201），悬尾强迫实验装置等），仪器品牌：Xmaze。

三、实验方法

    3.1松树皮提取物对小鼠学习记忆的影响

3.1.1穿梭实验

取40只健康小鼠，雌雄各半，随机分为4组，即空白对照组，松树皮高，中，低剂量组，每组10只，分别灌胃给药，空白对照组灌胃给与生理盐水。连续给药15天，与第11天开始穿梭实验。穿梭箱为一封闭的长方形盒子30cm×10cm×20cm，顶部有蜂鸣器 ，底部平行排列铜栅 ，间隔 0.5cm，铜栅可以通电。设定电刺激(1mA)时间15s ，蜂鸣 5s ，间隔 15s。训练时先将小鼠放入穿梭箱适应 3min，然后给予电刺激 ，小鼠受到电刺激后逃到另一端 ，蜂鸣及电刺激立即停止。每日训练1次 ，每次20个循环 ，共训练4天。第15天测验时，将小鼠放入穿梭箱一端，给予蜂鸣 5s ，然后通电 (1mA) ，间隔15s ，每次20个循环。记录小鼠电刺激成功逃避次数，逃避反应平均时间。

3.1.2 避暗实验  松树皮提取物对小鼠行为学的影响

以上实验结束后，动物休息两天但保持连续给药，于16次给药后1h进行避暗实验。实验装置分为明暗两室，两室之间有一直径为3 cm的圆洞，暗室底部铜栅通电。训练时先将小鼠放入反应箱中适应5 min，然后暗室底部铜栅通以40 V、50 Hz 交流电，将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室即受电击，记录5 min内进入次数(错误次数)，作为训练成绩。第17天给药后再次将小鼠放入明室，记录潜伏期和5 min内进入次数(错误次数)。 如果5 min时小鼠仍未进入暗室，错误次数记为0次，潜伏期记为300 s。(训练时第1次进入暗室的时间(潜伏期)大于180 s者弃去不用)

3.2松树皮提取物对小鼠焦虑行为的影响

3.2.1 高架十字迷宫实验

        以上实验结束后，动物休息两天但保持连续给药，于第21次给药后1小时进行实验。小鼠高架十字迷宫由 2 个开臂（长×宽：30cm×5 cm）和 2个闭臂（长×宽×高：30 cm×5 cm×15 cm） 组成，1个连接4只臂的中央平台（5 cm×5 cm），开放臂与封闭臂二者互相垂直成十字状。在迷宫正上方安装好摄像机，调整好影像画面，将4臂与中央平台划分为5个区域。将小鼠置于十字迷宫的中央平台，使其头部正对其中一个开放臂，开始计时，用动物行为活动记录分析系统记录并分析小鼠在迷宫内 5 min 的探究行为，包括小鼠进入 2 个闭臂的次数，进入2个开臂的次数，在开臂的活动时间，进入开臂次数的百分比等。每实验完1只小鼠，用75％酒精擦洗迷宫并挥干，再进行下一只小鼠的实验。

3.2.2 旷场实验

         以上实验结束后，动物休息两天但保持连续给药，于24次给药后1小时进行实验。旷场箱是一个单边长为 27.5 cm、 总边长为110 cm的正方形，在图形上将该正方形区分为周边、中央两个区域。中央区为套在大正方形中的一个单边长为13.75 cm、总边长为55 cm的小正方形，此小正方形到大正方形各边的距离相等。小正方形与大正方形之间的区域即为周边区。在旷场箱正上方安装好摄像机，调整好影像画面。将小鼠置于旷场箱的中央，开始计时，用动物行为活动记录分析系统记录并分析小鼠在旷场箱内 5 min 的自主探究行为，包括小鼠进入中央格的次数，在中央格的活动时间，进入外周格的次数，在外周格的活动时间等。每实验完1只小鼠，用75％酒精擦洗旷场箱并挥干，再进行下一只小鼠的实验。

3.3松树皮提取物对小鼠抑郁行为的影响

3.3.1 悬尾实验

       以上实验结束后，动物休息两天但保持连续给药，于第26次给药1 h 后进行悬尾实验，距小鼠尾尖部约1 cm 处用橡皮膏贴于丝线的一端，将之固定于水平放置的棒状物上，中间用板隔开，防止彼此看到对方，小鼠头部离台面约5 cm，室温18 ℃保持恒定，小鼠悬挂2 min 后，立即开始观察，观察持续4 min，记录4 min 内小鼠的不动( 小鼠在空中停止挣扎，或仅有细小的肢体运动) 时间。

3.3.2强迫游泳实验

以上实验结束后，动物休息两天但保持连续给药，于第28次给药1 h 后，将小鼠放入高20 cm、直径14 cm的圆柱型玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10 cm，水温( 25±1) ℃。小鼠游泳2 min 后， 立即开始观察，观察持续4 min， 记录4 min 内的小鼠不动的时间( 小鼠在水中停止挣扎， 或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)。

四、实验结果

4.1松树皮提取物对小鼠学习记忆的影    松树皮提取物对小鼠行为学的影响

结果见下表：

表4.1.1 松树皮提取物对小鼠穿梭实验的影响（土SD, n=10）

注：*与对照组比，p<0.05

表4.1.2 松树皮提取物对小鼠避暗实验的影响（土SD, n=10）

注：*与对照组比，p<0.05

从以上数据可以看出，**组和空白组在穿梭试验和避暗实验中的检测指标均未出现显著性差异，这表明松树皮提取物可能对小鼠的学习记忆行为影响不大。

4.2松树皮提取物对小鼠焦虑行为的影响

结果见下表

表4.2.1 松树皮提取物对高架十字迷宫实验的影响（土SD, n=10）

注：*与对照组比，p<0.05

表4.2.2 松树皮提取物对小鼠旷场实验的影响（土SD, n=10）

注：*与对照组比，p<0.05

在高架十字迷宫实验中，松树皮提取物中剂量组在开臂停留时间百分率要明显高于空白对照组，且有显著的统计学意义。但在旷场实验中，在中央格的次数并未增加，所以松树皮提取物对小鼠的焦虑行为影响，可能需要进行更加精密的实验进行验证。

结果见下表

表4.3 松树皮提取物对小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的影响（土SD, n=10）

注：*与对照组比，p<0.05

从上表可以看出，在悬尾实验中，松树皮提取物低剂量能显著降低小鼠的不动时间，提示可能有抗焦虑作用。但在强迫游泳试验中，虽然松树皮提取物低剂量组不动时间减少，但并没有统计学意义，可能是个体差异造成。这提示我们设计更加精密的抗抑郁实验能更好的检测其作用。

五、实验讨论

      穿梭和避暗实验能够评价动物主动回避和被动回避外界环境刺激的能力。高架十字迷宫实验和旷场实验，利用动物对新异环境的恐惧心理和探究特性形成的矛盾冲突来考察动物的焦虑水平。悬尾实验模型和强迫游泳实验模型不动时间是衡量动物行为改变的主要指标，既能反映造模成功与否，又可作为绝望动物行为的指标。以上实验在成功造模的基础上可以很好的探究**对学习记忆，焦虑，抑郁行为的影响。

      高架十字迷宫实验中，将动物置于迷宫的中央区，在一定时间内观察动物分别进入开臂和闭臂的时间与次数。由于开臂和外界相通，动物在好奇探究的同时也会产生焦虑反应。若焦虑水平高，则动物会离开开臂，反之则在开臂停留的时间长，对开臂的探究次数也增多。实验结果显示松树皮提取物中剂量组在开臂的停留时间明显延长，提示可能有抗焦虑的作用。悬尾实验中，动物的抑郁程度高，则不动时间长，不动时间短，活动时间长，则说说明抑郁程度低。从实验结果可以看出，松树皮提取物低剂量组，悬尾实验中不动时间明显低于空白对照组，提示松树皮提取物可能有抗抑郁的作用。

      本实验只是初步探究实验，得出的结果是为以后更加精密的实验做铺垫。